منابع پایان نامه درمورد مورفولوژی، شبیه‌سازی، ارزیابی پایداری، تجزیه و تحلیل آماری

فاز روغن در این مرحله از روغن کانولا استفاده شد. غلظت کلی امولسیفایرها در این مرحله ۸ درصد وزنی- وزنی بود (۱ قسمت امولسیفایر هیدروفیل و ۴ قسمت امولسیفایر لیپوفیل). امولسیفایر هیدروفیل DATEM و امولسیفایر لیپوفیل PGPR بود. امولسیون اولیه دارای نسبت حجمی فاز پراکنده ۵/۰ بود.
تهیه امولسیون به وسیله هموژنایزر انجام شد و در مرحله اول برای تشکیل امولسیون آب در روغن، با دور rpm9000 به مدت ۵ دقیقه انجام شد. سوسپانسیون سلولی توسط سرنگ استریل به صورت قطره قطره دا خل روغن ریخته شد.
در مرحله دوم ml40 از امولسیون آب در روغن اولیه به صورتی که در مرحله اول اضافه شد، به ml60 صمغ فارسی ۵ درصد اضافه شد. دور و زمان هموژنایزر در این مرحله به ترتیب rpm4500 و ۵ دقیقه بود (گنزالس و همکاران، ۲۰۰۹).

۳-۸- آنالیز رهایش سلولها از ریزپوشینهها
امولسیون دوگانه که حاوی سلولهای به دام افتاده بود در سرعت g15800 و به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ شدند. تحت این شرایط امولسیون دوگانه شکسته شده و سلولهای به دام افتاده آزاد شدند. سپس نمونههای ml1 از امولسیون شکسته در ml9 از بافر فسفات ۲/۰ مولار حل شد. پس از آن مجددا یک دقیقه با ورتکس هم زده شد تا اطمینان حاصل شود که رهایش سلولها از کپسول به صورت کامل صورت گرفته است. ۱۰۰ میکرولیتراز محلول فوق به یک میکروتیوب حاوی ۹۰۰ میکرولیتر بافر فسفات استریل اضافه شد و تا رقت ۸-۱۰ رقیق سازی انجام شد. به منظور ارزیابی جمعیت باکتری زنده مانده و رها شده از داخل ریزپوشینه ها از ۴ رقت آخر به روش مایلز- میزرا بر روی محیط کشت MRS جامد کشت داده شد و بعد از گرمخانهگذاری با دمای ۳۷ درجه سانتی گراد برای ۴۸ ساعت در انکوباتور بیهوازی، شمارش صورت گرفت. شمارش در سه تکرار و هر تکرار در سه مشاهده انجام شد(گنزالس و همکاران، ۲۰۰۹).

۳-۹- محاسبهی بازده فرایند ریزپوشانی
به منظورارزیابی بازده فرایند ریزپوشانی ابتدا شمارش سلولهای لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در سوسپانسیون اولیهای که به امولسیون دوگانه وارد شده حساب شد و سپس در مورد باکتریهای ریزپوشانیشده رهایش سلولها صورت گرفت و شمارش به روش بند ۳-۷ انجام شد. بازده ریزپوشانی۶۴ با فرمول زیر محاسبه شد: (EY = بازده فرایند ریزپوشانی)
(۳-۹)
N جمعیت باکتریهای زنده در هر گرم از ریزپوشینه و N0 جمعیت سلولی اولیه میباشد.

۳-۱۰- بررسی مورفولوژی ریزپوشینهها توسط میکروسکوپ نوری
از چندین نمونه ریزپوشینه تصویر تهیه شد و مورفولوژی ریزپوشینهها بررسی گردید. برای تهیهی تصویر نمونهها ابتدا از کپسولهای تهیه شده گستره تهیه شد.

۳-۱۱- تهیهی ماست پروبیوتیک و ارزیابی خصوصیات میکروبیولوژیکی، فیزیکی و حسی نمونههای ماست
۳-۱۱-۱- تهیه ماست پروبیوتیک
در شکل ۳-۱ فرایند تولید نمونههای ماست ارائه شده است. دو نمونه ماست، به منظور ارزیابی میزان بقاء سلولهای آزاد و ریزپوشانیشده لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 تهیه شد. یک نمونه ماست به عنوان نموته کنترل تهیه شد که به آن هیچ کدام از سلولهای آزاد یا ریزپوشانی شده اضافه نشدند. جهت تولید ماست پروبیوتیک،۲۰۰ سیسی از امولسیون تشکیل شده از سلولهای ریزپوشانیشده به ۲۰۰۰ سیسی شیر بدون چربی اضافه شد. همچنین ۲۰ سیسی از سوسپانسیون سلولی آزاد به همین مقدار شیر بدون چربی به منظور تولید ماست پروبیوتیک از سلولهای بدون ریزپوشینه اضافه شد. در نهایت نمونههای ماست در شرایط یخچال، در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند و آنالیز میکروبیولوژی و حسی آنها طی ۲۱ روز نگهداری بررسی شد. آنالیز روز صفر(بعد از سرد شدن نمونهها) و بقیه آنالیزها در روزهای ۳، ۶، ۹، ۱۲، ۱۵، ۱۸ و ۲۱ انجام شد. تمامی آزمایشات و شمارش سلولی تیمارها در سه تکرار و سه مشاهده انجام و نتایج به صورت میانگین دادهها گزارش شد)پیکوت و همکاران، ۲۰۰۴).
لازم به ذکر است نمونههای ریزپوشانیشده بدون اضافه شدن به ماست در یخچال به مدت ۲۱ روز نگهداری شد و زندهمانی باکتری در طی این دوره، مطابق با بند ۳-۸ بررسی شد.

تهیه شیر با مخلوط کردن ۲۴۰ گرم پودر شیرخشک بدون چربی با ۲ لیتر آب معمولی، تا رسیدن به ماده خشک ۱۲ درصد حجمی/ حجمی

پاستوریزه کردن سوسپانسیون حاصل در دمای ۵±۸۰ درجه سانتیگراد همراه با همزدن شدید و نگهداری در همین دما به مدت ۱۰ دقیقه

سرد کردن سریع تا دمای ۱±۴۲ درجه سانتیگراد

تلقیح کشت آغازگر تجاری ماست متشکل از استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس به شیر بدون چربی

توزیع شیر بدون چربی در۳ ظرف بزرگ جداگانه به عنوان (۱) نمونه کنترل، (۲) ماست پروبیوتیک بدون ریزپوشینه (۳) ماست پروبیوتیک ریزپوشانی شده

انتقال نمونههای ماست به ظروف پلاستیکی ۳۰۰ میلیلیتری و گرمخانه گذاری در دمای ۱±۴۵ درجه سانتیگراد تا رسیدن به pH=6/4

متوقف کردن تخمیر

انتقال نمونههای ماست به یخچال (دمای ۴ درجه سانتیگراد)

شکل ۳-۱- فرایند تولید ماست

۳-۱۱-۲- آزمونهای انجام شده بر روی ماست
الف- اندازهگیریی pH
این آزمون طبق استاندارد ملی ایران به شماره ۳۱۹۵ انجام گرفت. به این صورت که دستگاه pH متر به ترتیب با محلول بافر با ? pH= و محلول بافر با ? pH= کالیبره شد، سپس مقداری از نمونه در یک بشر خشک و تمیز ریخته و الکترود pHمتر درون آن قرار داده وپس از ثابت شدن عدد دستگاهpH نمونه دردمای اتاق (حدود ?? درجه سانتیگراد) خوانده شد. این آزمون برای هر نمونه در سه تکرار انجام شد.
ب- اندازه‌گیری اسیدیته ماست
۱۰ گرم نمونه ماست همگن‌شده درون ارلن حاوی ۱۰ میلی‌لیتر آب مقطر ریخته شد و به آن ۳-۲ قطره محلول شناساگر فنل‌فتالئین ۱% اضافه شد. سپس نمونه‌ها با کمک هیدروکسید سدیم ۱/۰ نرمال تا پدیدار شدن رنگ صورتی پایدار به مدت ۱۵ ثانیه تیتر شدند. میزان اسیدیته بر حسب درصد اسیدلاکتیک گزارش شد. این آزمون برای هر نمونه در سه تکرار انجام شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).
ج- اندازه‌گیری گرانروی
برای اندازهگیری گرانروی ماست از دستگاه ویسکومتر بروکفیلد DV2 استفاده شد. برای این منظور از ظروف بزرگ حاوی ۲۰۰ میلی‌لیتر ماست استفاده شد. قبل از اندازهگیری گرانروی ابتدا نمونه به وسیله یک میله شیشهای کاملا همگن شده ودر حمام آبی جهت رسیدن به دمای مورد نظر (OC 13) قرار گرفت. سپس برای اندازه‌گیری اسپیندل شماره ? و سرعت ?/۱ دور در دقیقه انتخاب شد. پس از گذشت مدت زمان ۹۰ ثانیه، یعنی پس از پایدار شدن وضعیت اسپیندل، عدد خوانده شده توسط دستگاه به عنوان گرانروی ماست ثبت شد. این آزمون برای هر نمونه در سه تکرار انجام شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).
د- آزمون سفتی (نفوذ ناپذیری)
برای انجام این آزمون از دستگاه اینستران استفاده شد. قطر پروب مورد استفاده ۵/۲۴ میلی متر، سرعت حرکت آن ۱۰۰ میلی‌متر بر دقیقه و عمق نفوذ پروب به داخل ماست هم‌نزده ۲ سانتی‌متر بود. میزان استحکام بافت نمونه‌های ماست در برابر اعمال نیرو بر حسب گرم گزارش شد. این آزمون برای هر نمونه در سه تکرار انجام شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).
۳-۱۱-۳- ارزیابی میزان بقا پروبیوتیکها درطول دوره نگهداری ماست
پایداری سلولهای پروبیوتیک در نمونههای آزاد و ریزپوشانیشده طی دورهی ۲۱ روزه بررسی شد. برای رهاسازی سلولهای ریزپوشینه، همانطور که در بخش ۳-۸ توضیح داده شد، از روش گنزالس و همکاران (۲۰۰۹) استفاده شد. در مورد پروبیوتیکهای آزاد، ml1 نمونه تحت شرایط استریل به لولههای حاوی ۹ میلیلیتر سرم فیزیولوژی ۸۵/۰ درصد استریل اضافه شد و به مدت ۱ دقیقه در شیکر قرار داده شد تا محلول سرم و ماست همگن شوند. سپس ۱۰۰ میکرولیتر از نمونهها به میکروتیوب حاوی ۹۰۰ میکرولیتر سرم ۸۵/۰ استریل اضافه شدند و تا رقت ۷ از هر نمونه تهیه شد. در نهایت مشابه شرایط ذکر شده در قسمت۳-۴ کشت سطحی صورت گرفت و بعد از ۴۸ ساعت شمارش انجام شد (سلطانا و همکاران، ۲۰۰۰).

۳-۱۲- بررسی میزان بقاء سلولهای آزاد و ریزپوشینه شده در محیط شبیهسازی شده گوارشی
ارزیابی میزان بقاء سلولهای آزاد و ریزپوشینه شده باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 در ماست و به صورت جداگانه و بدون ماست تحت شرایط شبیهسازی شده گوارشی بر اساس روش گنزالس و همکاران (۲۰۰۹) انجام شد.
جهت بررسی مقاومت کشتهای پروبیوتیکی، سلول آزاد و ریزپوشینه شده قبل از افزودن به ماست و بعد از پایان دوره نگهداری ماست به مدت ۲ ساعت در pH برابر با ۳/۲ در انکوباتور اوربیتال با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد و دور rpm100 قرار داده شد و به مدت ۲۴ ساعت در معرض محلول نمک صفراوی در انکوباتور با شرایط گفته شده قرار داده شد. دمای گرمخانهگذاری ۳۷ درجه سانتی‌گراد در نظر گرفته شد تا با شرایط بدن انسان شباهت بیشتری داشته باشد. سپس آنالیز تغییرات جمعیت سلولهای زنده در ریزپوشینهها همراه با رهایش سلول انجام شد. آزمایشات در سه تکرار و سه مشاهده انجام شد.

۳-۱۳- آماده سازی عصارههای شبیه‌سازی شده گوارشی
جهت تهیه عصاره شبیه سازی شده معده، ۹ میلیلیتر از محلول بافر سدیم فسفات ۰۵/۰ مولار تهیه شد و سپس به وسیله HCl 1/0 نرمال به pH برابر با ۳/۲ رسانده شد.
محلول نمک صفراوی با حل کردن پودر صفرا در MRS تا رسیدن به غلظت ۳/۰ درصد وزنی/حجمی تهیه شد.
تمامی محلولها روزانه تهیه شدند و توسط فیلترهای سرسرنگی ۲۲/۰ میکرومتر استریل شدند (گنزالس و همکاران، ۲۰۰۹).

۳-۱۴- ارزیابی پایداری سلولهای آزاد و ریزپوشینه شده در شرایط شبیه‌سازی شده گوارشی
سوسپانسیون میکروبی تازه بر اساس روش ذکر شده در بند ۳-۶ تهیه شد. ارزیابی سلولهای آزاد در محیط اسیدی به این صورت انجام شد که ابتدا ۱ میلی‌لیتر از سلول آزاد، به صورت جداگانه به ۹ میلی‌لیتر محلول بافر سدیم فسفاتی که توسط HCl 1/0 نرمال به pH برابر با ۳/۲ رسیده بود و ۹ میلی‌لیتر محلول MRS حاوی ۳/۰ درصد وزنی/حجمی محلول نمک صفراوی اضافه شد و به مدت ۲ ساعت در انکوباتور با دمای ۳۷ درجه سانتیگراد قرار داده شد.در مورد سلول ریزپوشینه شده قبل از افزودن به ماست و بعد از پایان دوره نگهداری نیز به همین روش انجام شد و به مدت ۲۴ ساعت گرمخانهگذاری انجام شد. بعد از طی شدن زمان لازم، طبق روشهای گفته شده در بند ۳-۵ شمارش سلولی انجام شد (گنزالس و همکاران، ۲۰۰۹).

۳-۱۵- ارزیابی حسی
این روش‌ بر اساس ارزیابی و تجزیه و تحلیل یک دسته خصوصیات مواد غذایی و با استفاده از حواس بویایی، چشایی و بینایی و بر مبنای روش‌های آزمون کاملاً عملی که امکان ارائه نتایج قابل تکرار و تجزیه و تحلیل آماری را می‌دهد، انجام گرفت. به عبارت دیگر، این روش‌ها بر اساس نظرات و تمایلات افراد قرار دارد. ممکن است افرادی که در این ارزیابی شرکت

Leave a Reply

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *