منبع پایان نامه ارشد درباره صنایع غذایی، نمونه برداری، بیوتکنولوژی، مورفولوژی

تهیهی آن از سدیم دیهیدروژن فسفات دو آبه و دیسدیم هیدروژن فسفات (مرک، آلمان) استفاده گردید.

ج- مواد مورد استفاده در تولید ماست پروبیوتیک
به منظور تهیهی ماست و برای حفظ یکنواختی نمونههای ماست طی انجام آزمایشها، از شیر خشک بدون چربی۵۴ ساخت شرکت زرین سپاهان استفاده شد.

د- مواد مورد استفاده در ارزیابی مقاومت باکتری پروبیوتیک در برابر محیط شبیهسازی شده گوارشی
در آزمایشات مربوط به ارزیابی مقاومت باکتری نسبت به محیط شبیهسازی شده گوارشی از هیدروکسید سدیم (NaOH) و اسید هیدروکلریدریک (HCl) تولید شده توسط شرکت مرک آلمان، بایل بووین۵۵ تولید شده توسط شرکت سیگما آلدریچ۵۶ آلمان استفاده شد.

۳-۱-۳- میکروارگانیسم مورد استفاده
میکروارگانیسمهای مورد استفاده شامل باکتری پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7 تهیه شده از آزمایشگاه میکروبیولوژی گروه علوم وصنایع غذایی دانشکدهی کشاورزی دانشگاه صنعتی و کشت‌های آغازگر در تولید ماست شامل لاکتوباسیلوسدلبروکی زیرگونه بولگاریکوس۵۷ و استرپتوکوکوس ترموفیلوس۵۸ تهیه شده از کریستین هانس دانمارک بودند.

۳-۲- عملیات و آزمونهای میکروبی
۳-۲-۱- فعال سازی و نگهداری باکتری پروبیوتیک
کشت خالص فریز شدهی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، در محیط کشت حاوی ۱۵ درصد گلیسرول که در فریزر oC80- نگهداری میشد، از نمونههای استوک۵۹ موجود در کلکسیون میکروبی آزمایشگاه میکروبیولوژی ـ بیوتکنولوژی گروه علوم و صنایع غذایی دانشگاه صنعتی اصفهان تهیه شد. برای فعال سازی باکتری، میکروتیوب محتوی لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7، بعد از خارج کردن از فریز، در شرایط کاملا استریل و در کنار شعله، در دمای محیط قرارداده شد تا ذوب شود، سپس میکروتیوب به لولهای حاوی ۱۰ میلیلیتر از محیط کشتMRS استریل انتقال داده شد و در انکوباتور میکروآئروفیل (با ۵ درصد دی اکسیدکربن، دمای ۳۷ درجه و به مدت ۱۸ ساعت) گرمخانهگذاری شد. از این کشت روی سطح لام، گسترهی۶۰ میکروبی تهیه شد و به منظور بررسی خصوصیات مورفولوژی باکتری، بوسیلهی میکروسکوپ نوری بررسی شد. پس از بررسیهای اولیه، سلولهای باکتری سه مرتبه و به صورت مداوم روی محیط MRS مایع و جامد کشت داده شدند. کشت ثانویه روی محیط کشت MRS جامد انجام شد و پلیتها در شرایط بیهوازی گرمخانهگذاری شدند. به منظور نگهداری کوتاه مدت، کلونیهای خالص تهیه شده بر روی محیط کشت MRS مورب۶۱ کشت داده شد و بعد از گرمخانهگذاری به یخچال با دمای ۴ درجه انتقال شد و ماهانه کشت مجدد انجام شد. به منظور نگهداری طولانی مدت، ۵۰۰ میکرولیتر از کشت مایع فعال به میکروتیوب حاوی ۵۰۰ میکرولیتر گلیسرول ۱۵درصد حجمی/ حجمی استریل خالص اضافه شد و بلافاصله در ازت مایع منجمد شد. این نمونهها در فریزر ۸۰- نگهداری شدند. برای تهیهی کشت فعال در هر مرحله، کلونیهای خالص نگهداری شده در یخچال را در محیط MRS مایع تلقیح کرده و باکتریها به مدت ۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجه گرمخانه‌گذاری شدند.

۳-۲-۲- آزمونهای بیوشیمیایی به منظور شناسایی باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم A7

۱- رنگ آمیزی گرم
به منظور رنگآمیزی گرم از کلونی تازه، گسترهی میکروبی تازه تهیه شد. پس از خشکشدن نمونه در مجاورت هوا، تثبیت حرارتی صورت گرفته و سپس رنگ کریستال بنفش۶۲ به گستره اضافه شد. بعد از یک دقیقه به صورت ملایم با آب شسته شد تا رنگ اضافی پاک شود. در مرحلهی بعد از محلول لوگول استفاده شد. مشابه با مرحلهی قبل، بعد از یک دقیقه گسترهی میکروبی با جریان ملایم آب شست و شو داده شد و به منظور رنگ بری نیز، در مرحله بعد، الکل مطلق به گستره اضافه شد و بعد از ۳۰ ثانیه سطح لام شسته شد. در نهایت سافرانین به مدت یک دقیقه به گستره اضافه شد و بعد از شستن لام و خشک کردن آن در مجاورت هوا شکل، آرایش سلولی و تعیین گرم با استفاده از میکروسکوپ نوری مشخص شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).

مطلب مشابه :  پایان نامه با واژه های کلیدی بیمارستان، جمع آوری اطلاعات، ذخیره سازی، مدیریت پسماند

۲- آزمون کاتالاز
برای انجام این آزمایش ابتدا یک قطره آب اکسیژنهی ۳ درصد (V/V) روی لام شیشهای قرار داده شد و توسط یک آنس استریل بخشی از یک کلونی تازه به آن اضافه شد و کاملا مخلوط شد. تشکیل یا عدم تشکیل حباب دو مرتبه بررسی شد؛ یکبار بلافاصله بعد از اضافه کردن کلونی و یکبار ۵ دقیقه بعد از اضافه کردن کلونی بررسی شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).

۳- آزمون اسپورزا بودن
برای تعیین اسپورزا بودن باکتری از روش شفر- فولتون۶۳ استفاده شد. به این صورت که ابتدا گسترهی میکروبی تهیه شد و پس از تثبیت حرارتی رنگ آمیزی با مالاشیت سبز به مدت ۵ دقیقه انجام شد و بعد از شست و شو با جریان ملایم آب سفرانین به مدت یک دقیقه اضافه شد. سپس سطح اسلاید شسته و خشک گردید و در نهایت گسترهی میکروبی با میکروسکوپ نوری، به منظور حضور یا عدم حضور اسپور بررسی شد (میرلوحی، ۱۳۸۸).
۳-۳- آنالیز شیمیایی شیر خشک بدون چربی و صمغ فارسی
کلیه آزمونهای شیمیایی در سه تکرار انجام شدند.

۳-۳-۱- اندازه‌گیری خاکستر
برای اندازهگیری خاکستر، کروزهها را به وزن ثابت رسانده شد. به این منظور کروزهها به مدت ۳۰ دقیقه در دمای ۶۰۰ درجه سانتیگراد قرار داده شدند. سپس یک تا ۲ گرم از نمونههای مورد بررسی، درون کروزه وزن شدند و تا پایان متصاعد شدن دود روی اجاق الکتریکی قرار داده شد. سپس کروزه‌ها در دمای ۵۵۰ تا ۶۰۰ درجه به مدت ۵ ساعت قرار داده شدند. در انتهای این زمان نباید دیگر ذرات سیاه رنگ در کروزه مشاهده شود. سپس کروزهها را در دسیکاتور قرار داده شدند و نمونهها وزن شدند. درصد خاکستر از فرمول زیر محاسبه شد (سوزان- نیلسون، ۲۰۱۰):

= درصد خاکستر

۳-۳-۲- اندازهگیری رطوبت و ماده خشک
ابتدا ظروف آلومینیومی به همراه درب آنها در آون با دمای ۱۰۵ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ دقیقه قرار گذاشته شد. سپس آنها را به دسیکاتور انتقال داده تا سرد شده و به دمای ثابت برسند. ۱ تا ۲ گرم نمونه در ظروف توزین شد و تا زمان رسیدن به وزن ثابت در آون با دمای ۱۰۵ درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. بعد از خارجکردن از آون و سرد کردن ظروف حاوی نمونه مجددا آنها را توزین کرده و درصد رطوبت یا ماده خشک با استفاده از فرمولهای زیر محاسبه شدند (واسیلجویک، ۲۰۰۷).

درصد رطوبت-۱۰۰= درصد ماده خشک
۳-۳-۳- اندازه گیری چربی
۳-۳-۳-۱- روش سوکسله
اندازهگیری چربی، برای صمغ فارسی و شیر خشک با روش سوکسله انجام شد و درصد چربی با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد:
= درصد چربی

۳-۳-۳-۲- روش ژربر
اندازهگیری چربی برای نمونههای ماست به روش ژربر انجام شد.

۳-۳-۴- اندازهگیری پروتئین و ازت کل
اندازهگیری پروتئین و ازت کل در سه مرحله هضم، تقطیر و تیتراسیون انجام شد.

الف- هضم
در این مرحله ۵/۱ گرم نمونه استفاده شد، ولی برای نمونههایی که مقدار پروتئین بالا دارند ۵/۰ گرم از نمونه کافی میباشد. ۵/۰ گرم از نمونه شیر خشک و ۵/۱ گرم نمونههای ماست و صمغ فارسی را در فلاسک هضم مخصوص کلدال ریخته و ۱/۱۱ گرم کاتالیزور(مخلوط سولفات پتاسیم، سولفات مس و سلنیم به ترتیب با نسبت ۱:۱۰:۱۰۰) همراه با ۲۵ میلیلیتر اسیدسولفوریک غلیظ به آن اضافه شد. ابتدا به فلاسکهای روی دستگاه هضم مخصوص، حرارت ملایم داده شد تا کف کردن محلولها متوقف شود. سپس حرارت را بالا برده تا محلولها بجوشند. این عمل تا زمان روشن شدن رنگ محلولها ادامه یافت. لازم به ذکر است نمونههای ماست بعد از اینکه در فلاسک هضم ریخته شدند، به مدت ۱ساعت درون آون و در دمای ملایم خشک شدند.

مطلب مشابه :  پایان نامه ارشد درمورد سند رسمی، ثبت اسناد، تعارض قوانین، زبان فارسی

ب- تقطیر
بعد از مرحلهی هضم و تشکیل محلول زلال، نمونهها را در دستگاه تقطیر قرار داده و ۴۰ میلیلیتر آب مقطر و ۱۲۰ میلیلیتر سود ۵۰ درصد به آنها اضافه شد و با برقراری جریان در داخل دستگاه، آمونیاک آزاد شد و در ارلن مایر حاوی ۵۰ میلیلیتر اسید بوریک ۲ درصد و چند قطره معرف فنول رد حل و جمعآوری شد. حل شدن تدریجی آمونیاک باعث تغییر رنگ نمونههای درون ارلن مایر به زرد شد. مرحلهی تقطیر تا زمان رسیدن محلولها به حجم ۲۰۰ میلی لیتر ادامه یافت.

ج- تیتراسیون
بعد از خارج کردن نمونهها از زیر دستگاه تقطیر، آمونیاک موجود در آنها با اسید کلریدریک ۱/۰ نرمال تیتر شد و درصد پروتئین با فرمول زیر محاسبه شد (سوزان – نیلسون، ۲۰۱۰).

۳۸/۶× درصد ازت = درصد پروتئین

۳-۳-۵- اندازهگیری اسیدیته بر حسب اسید لاکتیک
۱ تا ۲ گرم نمونه را در ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر با دمای ۸۰ درجه سانتیگراد حل کرده سپس در برابر معرف فنلفتالئین ۲ درصد، تا ایجاد رنگ صورتی پایدار با سود ۱/۰نرمال استاندارد شده، تیترشد. مطابق رابطه زیر اسیدیته بر حسب اسیدلاکتیک تعیین گردید (سوزان- نیلسون، ۲۰۱۰):

لاکتیک

۳-۵- رسم منحنی رشد
برای رسم منحنی رشد ۱ درصد از کشت فعال به ۵۰ میلیلیتر MRS مایع اضافه شد و در انکوباتور CO2- دار در دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد نگهداری شد. ابتدا به مدت ۲ ساعت، هر نیم ساعت یکبار و بعد از این مدت هر دو ساعت یکبار نمونه برداری انجام شد و هر نمونه تا رقت ۱۰۷ رقیق شد و از رقتهای ۱۰۴ تا ۱۰۷ به روش مایلز- میزرا بر روی محیط MRS جامد کشت داده شد. در این روش هر پتری به ۴ قسمت مساوی تقسیم شده و در هر قسمت ۴۰ میکرولیتر از رقت مورد نظر کشت داده میشود. پس از خشک شدن، پلیت ها به انکوباتور بیهوازی با دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد منتقل شده و بعد از ۴۸ ساعت شمارش انجام می شود. جمعیت باکتریها از حاصلضرب این عدد در عکس ضریب رقت و در ۲۵ به دست میآید (نوربخش، س. ح، ۱۳۹۱).

۳-۶- تهیه سوسپانسیون فعال سلولی جهت ریزپوشانی
برای آمادهسازی سوسپانسیون فعال سلولی ده درصد از ساب کالچر نهایی به دو ارلن مایر یک لیتری محتوی ۵۰۰ سی‌سیMRS مایع استریل انتقال داده شد و به مدت ۱۸ ساعت در دمای ۳۷ درجهی سانتیگراد تحت شرایط بیهوازی (۵ درصد CO2) انکوبهگذاری شد. بعد از ۱۸ ساعت که همزمان با شروع فاز سکون در باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم است، تودهی سلولی توسط سانتریفیوژ (۵ دقیقه با دمای ۴ درجه سانتی گراد و شتاب g? 4500) جمعآوری شد. سپس محیط کشت را جدا کرده و تودهی سلولی دو مرتبه به وسیله پپتون واتر ۱/۰ درصداستریل تحت شرایط قبلی شسته شد. در نهایت تودهی سلولی در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد. شمارش سلولی سوسپانسیون ۴۸ ساعت بعد از کشت سطحی بر روی MRS جامد و در شرایط بیهوازی و دمای ۳۷ درجه انجام شد (چاواری و همکاران، ۲۰۱۰).

۳-۷- فرایندهای ریزپوشانی
آمادهسازی امولسیون دوگانه
امولسیون در دمای اتاق، با استفاده از روش امولسیون دو مرحلهای تهیه شد. در مرحله اول امولسیون اولیه آب در روغن به وسیلهی توده سلولی حاویcfu/ml 108 باکتری است، به امولسیون تبدیل میشود. برای فاز روغن در این

دیدگاهتان را بنویسید